RNA和DNA提取:
裂解:裂解公式可能因您要提取 DNA 還是 RNA 而異,但共同點是含有高濃度離液鹽的裂解緩沖液。
Chaotropes(離液劑)的作用:Chaotrope會破壞氫鍵及疏水間的相互作用。離液鹽包括鹽酸胍、硫氰酸胍、尿素和高氯酸鋰。
洗滌劑:除了離液劑外,裂解緩沖液中通常還有一些去污劑,以幫助蛋白質溶解和裂解。
溶jun酶和蛋白酶K:根據樣品類型,也可以使用酶進行裂解。蛋白酶 K 就是其中之一,實際上在這些變性緩沖液中效果較好;當蛋白質變性增多,蛋白酶 K 的作用也會相應增強。然而,溶jun酶在變性中不起作用,因此溶jun酶處理通常在添加變性鹽之前進行。
RNA和DNA提取實驗中的問題
1.產量低
如果您遇到的 DNA/RNA 產量低于您對樣品的預期,則需要考慮許多因素。通常,這是一個裂解問題。不完wan全裂解是產量低的主要原因。它也可能是由不正確的綁定條件引起的。確保使用新鮮的優質乙醇(100% 200 標準)稀釋緩沖液或添加到結合的步驟。劣質乙醇或舊庫存可能已經吸收了水分,并且濃度不正確。如果洗滌緩沖液制備不正確,您可能正在洗掉提取的 DNA 或 RNA。
2.低純度
如果提取的 DNA 被蛋白質污染(低 260/280),那么您可能開始時樣品過多,而蛋白質沒有完wan全去除或溶解。
如果 DNA 的 260/230 比率不佳,則問題通常是結合或洗滌緩沖液中的鹽分。確保使用最高質量的乙醇來制備洗滌緩沖液,如果問題仍然存在,請再次洗滌色譜柱。
與其他樣品相比,一些樣品含有更多的抑制劑。環境樣品特別容易出現純度問題,因為腐殖質在提取過程中會被溶解。
腐殖質的行為與 DNA 相似,很難從硅膠柱中去除。
3.降解
降解問題是RNA制備中常常到的問題。因為在 RNA 提取過程中,樣品儲存不當或裂解效率低等情況都會導致降解。對于 DNA 提取,降解不是一個大問題,因為對于 PCR,DNA 可以被剪切并且工作正常,如果不希望有較多剪切的 DNA,可以使用弱裂解的方法。
PCR 清理時的注意事項
PCR 凈化其實并不是 DNA 提取技術本身,但它是一種效率高且簡單的技術,它只是添加高濃度的結合鹽(通常每體積 PCR 反應 3-5 體積鹽)和離心來過濾。
在實驗過程中,PCR Clean-up 試劑盒出現故障也會導致整個實驗功虧一簣。
因為在PCR 反應中有較多吸收 260 度紫外線的物質,比如:核苷酸、去污劑、鹽和引物。所以,PCR 凈化試劑盒經常無法正常工作可能是由于 PCR 反應失敗所造一般成較難清理。